僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!

[預(yù)期應(yīng)用]

本試劑盒運(yùn)用雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清 或其它相關(guān)生物液體中待檢測(cè)指標(biāo)含量。

[試劑盒內(nèi)容]

[標(biāo)本的采集與保存]

1、 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4^oC過(guò)夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20^oC或-80^oC保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2、 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8^oC 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20^oC或-80^oC保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3、 組織勻漿：

1） 取適量組織塊，于預(yù)冷PBS（0.02mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱(chēng)重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；

2） 可同時(shí)選用多種勻漿方法達(dá)到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL預(yù)冷PBS進(jìn)行充分研磨，該過(guò)程需在冰上進(jìn)行（有條件實(shí)驗(yàn)室可選用機(jī)器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融進(jìn)一步處理（超聲破碎過(guò)程中注意冰浴降溫；反復(fù)凍融法可重復(fù)2次）。

3） 將制備好的勻漿液于5000×g離心5分鐘，留取上清即可檢測(cè)。

4、 細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20^oC或-80^oC保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注意：

1、 以上標(biāo)本均需密封保存，4^oC保存應(yīng)小于1周，-20^oC不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月，-80^oC不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月。

2、 標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

3、 標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。

[標(biāo)本處理]

1、 Uscn,Inc.只對(duì)試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對(duì)因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請(qǐng)使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。

2、 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)標(biāo)本含量，如果標(biāo)本濃度過(guò)高，應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋?zhuān)瓜♂尯蟮臉?biāo)本符合試劑盒的檢測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

3、 若所檢樣本不包含在說(shuō)明書(shū)所列樣本之中，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效性，并注意留存樣本。

4、 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致  ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。

5、 若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類(lèi)樣本干擾因素 較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時(shí)間等，所以可能存在檢測(cè)不出的情況。

6、 某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測(cè)抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測(cè)出。

7、 建議使用新鮮樣本，保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)存在蛋白降解或變性導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏 差。

[操作步驟]

1、 加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(見(jiàn)試劑準(zhǔn)備2)。空白孔加100μL(見(jiàn)試劑準(zhǔn)備第二步最后一管)，余孔加待測(cè)樣品100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37^oC溫育2小時(shí)。

2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。

3、 每孔加檢測(cè)溶液A工作液100μL(臨用前配制)，酶標(biāo)板加上覆膜，37^oC溫育1小時(shí)。

4、 棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)，重復(fù)洗板3次。最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。自動(dòng)洗板機(jī)亦可。

5、 每孔加檢測(cè)溶液B工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37^oC溫育30分鐘。

6、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。

7、 每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37^oC避光顯色(反應(yīng)時(shí)間控制在15-25分鐘，不要超過(guò)30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止)。

8、 每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請(qǐng)輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。

9、 在確保酶標(biāo)板底無(wú)水滴及孔內(nèi)無(wú)氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(O.D.值)。

注意：

1、 試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說(shuō)明書(shū)要求保存，以備下次使用。

2、 加樣：實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡，將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。加樣或加試劑時(shí)，第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。因此，一次加樣時(shí)間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)最好控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

4、 洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過(guò)程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí) 驗(yàn)過(guò)程中。

5、 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘觀察一次)，如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

6、 底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

7、 如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。